Development of solid supports functionalized by aptamers for the analysis of trace ions in complex samples
Développement de supports solides fonctionnalisés par des aptamères pour l’analyse d’ions présents à l’état de trace dans des échantillons complexes
Résumé
Many metal ions are recognized as essential for the proper functioning of our organism, but some of them, such as cadmium or lead ions, are harmful even in trace amounts. Other ions, like copper ions, can also become harmful when a deficiency or excess is observed in the body. Standards and normal thresholds have been established, particularly in food products, as well as in biological matrices such as blood. Therefore, it is necessary to be able to quantify these trace metals in complex matrices. In order to overcome the performance limitations of elemental analysis instruments, such as lack of specificity or sensitivity to matrix effects, a preliminary sample treatment step is required, such as solid-phase extraction. However, conventional supports lack specificity, leading to the co-extraction of multiple metal ions. To overcome this lack of specificity, new highly specific supports are being developed, such as ion-imprinted polymers whose potential has already been demonstrated, but whose synthesis and implementation can be complex. The objective of this thesis is to investigate the use of aptamers, simple DNA or RNA strands, to develop highly specific and selective extraction supports for metal ions. While their potential has already been demonstrated for the extraction of organic molecules, few studies have focused on the extraction of metal ions such as cadmium, lead, and copper, which are targeted in this study. Following a literature review on the use of specific aptamers for these metal ions, especially in the context of sensor development, specific sequences of interest were selected for each target. These sequences were covalently attached to activated CNBr Sepharose. After evaluating the theoretical capacity of the supports by measuring the grafting rates, a detailed study of the effect of percolation and washing media on the retention of targeted ions was conducted thanks to ICP-MS measurement of each fraction, demonstrating the strong influence of ions present in the medium on specificity and selectivity. These two parameters were investigated respectively by studying the retention of other divalent cations on sorbent grafted with specific aptamers and by studying the retention of targeted ions on supports grafted with so-called control sequences, i.e. with no known affinity for targeted ions. After optimizing the procedures for each of the most promising supports capable of extracting one of the target ions, the capacities of the supports were determined. Then, the supports were successfully applied to the extraction of targeted ions from real samples such as serum, illustrating the strong potential of aptamers for the extraction of metal ions.
De nombreux ions métalliques sont reconnus comme essentiels au bon fonctionnement de notre organisme, mais certains tels que les ions cadmium ou plomb sont eux nocifs, même à l’état de traces. D’autres ions tels que les ions cuivre peuvent s’avérer nocif lorsqu’un déficit ou un excès est constaté dans l’organisme. Des normes et seuils de normalité ont donc été fixés, notamment dans les denrées alimentaires, mais aussi dans les matrices biologiques comme le sang. Il est alors nécessaire de pouvoir quantifier ces métaux à l’état de traces dans des matrices complexes. Afin de pallier les limites en termes de performances des instruments d’analyse élémentaire comme le manque de spécificité ou encore la sensibilité aux effets de matrices, une étape préalable de traitement de l’échantillon est nécessaire, telle que l’extraction sur phase solide. Cependant les supports conventionnels manquent de spécificité, entrainant la co-extraction d’autres ions. Pour combler ce manque de spécificité, de nouveaux supports hautement spécifiques sont en cours de développement, tels que les polymères à empreintes ioniques, dont le potentiel à d’ores et déjà été démontré mais dont la synthèse et la mise en œuvre peuvent s’avérer complexes. L’objectif de cette thèse est d’investiguer l’utilisation d’aptamères, de simples brins d’ADN ou d’ARN, afin de développer des supports d’extraction hautement spécifiques et sélectifs aux ions métalliques. Si leur potentiel a déjà été démontré pour l’extraction de molécules organiques, peu de travaux concernent à ce jour l’extraction d’ions métalliques tels que ceux ciblés dans cette étude à savoir les ions cadmium, plomb et cuivre. Après une étude bibliographique portant sur l’utilisation d’aptamères spécifiques de ces ions métalliques, notamment dans le cadre du développement de capteurs, des séquences d’intérêt ont été sélectionnées pour chacune des cibles. Ces séquences ont été greffées de manière covalente sur de la Sépharose activée CNBr. Après avoir évalué la capacité théorique des supports obtenus par la mesure des taux de greffage, une étude approfondie de l’effet des milieux de percolation et de lavage sur la rétention des ions ciblés a été réalisée grâce à la mesure de chacune des fractions en ICP-MS, démontrant la forte influence des ions présents dans le milieu sur la spécificité et la sélectivité. Ces deux paramètres ont été étudiés respectivement par l’étude de la rétention d’autres cations divalents sur les supports greffés par les aptamères spécifiques et des ions ciblés sur des supports greffés par des séquences dites de contrôle, à savoir n’ayant pas d’affinité connue pour les ions ciblés. Après optimisation des protocoles pour chacun des supports les plus prometteurs permettant d’extraire l’un des ions cibles, les capacités des supports ont été déterminées. Enfin, les supports ont permis avec succès l’extraction des ions ciblés d’échantillons réels tels que le sérum, illustrant le fort potentiel des aptamères pour l’extraction d’ions métalliques.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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