Biosenseurs bactériens bioluminescents pour la détection de métaux en solution : mesurer et formaliser les relations entre réponse temporelle des biosenseurs, métabolisme cellulaire et biodisponibilité/spéciation des métaux - INSU - Institut national des sciences de l'Univers
Thèse Année : 2023

Whole-cell bioluminescent sensors for the detection of metals in aquatic media : experimental and theoretical assessments of relationships between cell response over time, cell metabolism and metal speciation/bioavailability

Biosenseurs bactériens bioluminescents pour la détection de métaux en solution : mesurer et formaliser les relations entre réponse temporelle des biosenseurs, métabolisme cellulaire et biodisponibilité/spéciation des métaux

Résumé

Whole-cell biosensors are organisms genetically modified to detect analytes or stresses caused by toxic compounds in aquatic environments. By design, bacterial sensors responding to a given metallic element 'directly' probe its bioavailability as it crosses the membrane, exerts its effects or is transformed by the cell. However, the signals generated by metal-specific bioluminescent biosensors (of interest in this PhD) are difficult to decipher due to their non-trivial dependence on physicochemical and biochemical factors controlling metal speciation, bioavailability and 'conversion' into light. Limits include (i) the use of equilibrium models for metal speciation where lability of metal complexes is not considered, (ii) a most often empirical exploitation of bioluminescence peak without analysis of the entire dependence of the signal on time, however rich of information, and (iii) the absence of an integrated theoretical framework for the various biophysicochemical processes at the origin of the response, from the reactive transfer of metals to the surface of the biosensor, the internalization of the bioactive metal forms, up to the very photons emission stage. The aim of this PhD work was to generate, via experiments and theory, some basic knowledge for a better evaluation of metal bioavailability by biosensing and for a design of alternatives to aforementioned limits. In a first part, we show how the time-response of cadmium-sensitive biosensors (PzntA-luxCDABE E. coli) is mediated by nutrients bioavailability in solution (amino acids, sugars) and by resulting couplings between stringent response and catabolic repression. These couplings generate bioluminescence signals that differ in terms of position, number, amplitude and shape of the observed peaks, these properties being all controlled by the nutritive quality of the medium. Based on a previously published formalism, bioluminescence signals are reconstructed, enabling cell photoactivity to be assessed as a function of time and correlated with changes in metabolism following deficiencies in amino acids and/or sugars. These results clarify the need to consider metabolism and associated typology of biosensor response when estimating metal bioavailability in solution. In a second part, we highlight the quantitative connections between time-responses of metal-specific biosensors and of their non-specific constitutively light-emitting 'counterparts'. Using a theoretical formalism we develop to model the response of the latter biosensor type, we demonstrate how the distinct signals of the two types of biosensors actually reflect similar changes in metabolic activity and cellular photoactivity over time despite differences in the respective actuation modes of their reporter gene. In a final part, we report the responses of Cd-responsive PzntA-luxCDABE E. coli measured over a large range of biosensor concentration and concentration of various molecular and particulate cadmium chelators. Data are qualitatively interpreted by a mechanistic theory we elaborate to interconnect at a dynamic level the time-response of biosensors, cell metabolism and metal speciation/bioavailability properties beyond the thermodynamic framework of classical models (e.g. BLM, FIAM) and related softwares (e.g. Visual MINTEQ). In line with theory, we demonstrate the non-linearity of bioluminescent response under metal depletive conditions in solution, and the existence of time shifts in bioluminescence maxima with increasing concentration of biosensors and complexing agents. We explain the origin of these shifts by analyzing the coupling between activation kinetics of cell photoactivity and metal depletion kinetics in solution, and we show explicitly how metal depletion kinetics reflects metal bioavailability properties including lability of metal complexes.
Les biosenseurs à cellule entière sont des organismes modifiés génétiquement pour détecter certains analytes ou stress causés par des composés toxiques des milieux aquatiques. Par construction, les biosenseurs bactériens répondant à un élément métallique donné sondent ‘directement' sa biodisponibilité lorsqu'il traverse la membrane, exerce ses effets ou est transformé par la cellule. Cependant, les signaux générés par les biosenseurs bioluminescents spécifiques à un métal (systèmes d'intérêts dans cette thèse) sont difficiles à déchiffrer de par leur dépendance non triviale aux facteurs physicochimiques et biochimiques qui contrôlent la spéciation du métal, sa biodisponibilité et sa ‘conversion' en lumière. Les limites incluent (i) le recours à des modèles à l'équilibre de spéciation des métaux où la labilité des complexes métalliques n'est pas considérée, (ii) une exploitation souvent empirique du pic de bioluminescence sans une analyse de toute l'évolution temporelle du signal pourtant riche d'informations, et (iii) l'absence d'un cadre théorique pour une vision intégrée des processus biophysicochimiques à l'origine de la réponse, depuis le transfert réactif des métaux vers les biosenseurs, l'internalisation des formes métalliques bioactives, jusqu'à l'émission de photons. Cette thèse avait pour objectif de contribuer à proposer des alternatives à ces différentes limites. Dans une première partie, nous montrons comment la réponse temporelle de biosenseurs sensibles au cadmium (PzntA-luxCDABE Escherichia coli) est modulée par la biodisponibilité des nutriments en solution (acides aminés, sucres) et par les couplages entre réponse stringente et répression catabolique. Ces couplages génèrent des signaux de bioluminescence qui différent en termes de position, nombre, amplitude et forme des pics observés, ces propriétés étant toutes contrôlées par la qualité nutritive du milieu. Sur la base d'un formalisme précédemment publié, les signaux de bioluminescence sont reconstruits, ce qui permet d'évaluer la photoactivité cellulaire en fonction du temps et de la corréler aux changements de métabolisme dus aux carences en acides aminés et/ou sucres. Ces résultats clarifient la nécessité de considérer le métabolisme et la typologie associée de réponse du biosenseur pour estimer la biodisponibilité des métaux en solution. Dans une deuxième partie, nous mettons en évidence les connections quantitatives entre réponses temporelles de biosenseurs spécifiques aux métaux et leurs ‘équivalents' non-spécifiques qui émettent la lumière de façon constitutive. A l'aide d'une formalisation théorique de la réponse de biosenseurs non-spécifiques, nous démontrons comment les réponses distinctes des deux types de biosenseurs reflètent au cours du temps des changements similaires d'activité métabolique et de photoactivité cellulaire malgré les modes différents d'actuation de leur gène rapporteur. Dans une dernière partie, nous présentons les réponses de PzntA-luxCDABE E. coli inductible au Cd, mesurées pour une large gamme de concentrations de biosenseurs et de différents chélateurs moléculaires et particulaires. Les données sont interprétées qualitativement par une théorie mécaniste développée pour interconnecter réponse temporelle des biosenseurs, métabolisme cellulaire, et biodisponibilité/spéciation des métaux en dépassant le cadre thermodynamique des modèles classiques de spéciation/bioaccumulation. En accord avec la théorie, nous démontrons la non-linéarité des réponses en condition déplétive des métaux en solution, ainsi que l'existence de décalages temporels des pics de bioluminescence pour des concentrations croissantes en biosenseurs et chélateurs. Nous expliquons l'origine de ces décalages par l'interférence entre les cinétiques d'éveil de la photoactivité cellulaire et de déplétion du métal en solution, et nous démontrons comment la cinétique de déplétion reflète la biodisponibilité du métal et la labilité des complexes métalliques.
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Citer

Eva Delatour. Biosenseurs bactériens bioluminescents pour la détection de métaux en solution : mesurer et formaliser les relations entre réponse temporelle des biosenseurs, métabolisme cellulaire et biodisponibilité/spéciation des métaux. Sciences de l'environnement. Université de Lorraine, 2023. Français. ⟨NNT : 2023LORR0310⟩. ⟨tel-04700419⟩
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